前言

      無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，一旦生長直徑超過1~2 mm，都會(huì)有血管生成。這是由于腫瘤細(xì)胞自身可分泌多種生長因子，誘導(dǎo)血管生成。多數(shù)惡性腫瘤的血管生成密集且生長迅速。因此，血管生成在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，抑制這一過程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。于是體外的血管生成實(shí)驗(yàn)就能很好的模擬腫瘤的血管發(fā)生過程，并且適合研究藥物對(duì)這一過程的影響實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)以HUVEC細(xì)胞為例，介紹這一實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)過程。

圖一  血管生成鏡檢圖

一.實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

2.實(shí)驗(yàn)方法：
2.1實(shí)驗(yàn)流程介紹

圖二  實(shí)驗(yàn)流程圖

（提前將Matrigel融化，鋪于ibidi血管生成載玻片的下孔中，待膠凝后，將細(xì)胞懸液加入血管生成載玻片上孔中，成管后使用顯微鏡觀察。）

2.2耗材結(jié)構(gòu)介紹

圖三   血管生成載玻片縱截面示意圖

（Matrigel鋪在下孔，細(xì)胞鋪在Matrigel上，上孔充滿培養(yǎng)基）

2.3數(shù)據(jù)分析流程介紹

圖四  實(shí)驗(yàn)結(jié)果收集和分析流程圖

（在特定的時(shí)間點(diǎn)采集圖片，并且進(jìn)行圖像分析（Wimasis全自動(dòng)分析）測(cè)量小管長度，成環(huán)數(shù)，細(xì)胞覆蓋面積和結(jié)點(diǎn)。之后在對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果。）

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1、準(zhǔn)備基質(zhì)膠

1. 實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使膠能緩慢融化。（注意：同樣要準(zhǔn)備一些4。C預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel）

2.開始實(shí)驗(yàn)前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。

3.打開滅菌包裝，取出ibidi血管生成載玻片。

4.每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng)，并且有可能移液槍不準(zhǔn)確，有可能打入10μl的膠，卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣，必然會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。

如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel：

我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示，垂直透過每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

3、凝膠

1. 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
2. 準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。
3. 將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。
4. 將整個(gè)培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié)。
5. 等待同時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。

3、鋪細(xì)胞

加入細(xì)胞的量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以在正式實(shí)驗(yàn)開始之前，要對(duì)不同類型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。獲得佳比例的細(xì)胞密度。我們今天的實(shí)驗(yàn)使用HUVEC細(xì)胞，每孔種10000個(gè)細(xì)胞即可。

1. 準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液，充分混勻。
2. 將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
3. 每孔加入50μl的細(xì)胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠?？梢允褂门艠?。
4. 同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細(xì)胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。
5. 蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細(xì)胞都會(huì)沉下去落在Matrigel的表面。

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?4、采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果
可以按照細(xì)胞的生長速度定時(shí)采集圖像，并且對(duì)其成管長度，覆蓋面積，成環(huán)數(shù)，結(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測(cè)量和記錄，并且對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

5、免疫熒光染色
根據(jù)需要，可以對(duì)成管結(jié)果進(jìn)行免疫熒光染色。
小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基，注意不要碰到膠或者細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。
加入50μl用無血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl)，使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)。
在室溫下避光孵育30分鐘。
使用PBS清洗三次，注意，PBS要緩緩加入上孔，以免沖擊掉細(xì)胞。
使用 485 nm/ 529 nm進(jìn)行免疫熒光成像。

實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢(shì)

1.這個(gè)實(shí)驗(yàn)方法能節(jié)省更多基質(zhì)膠，降低實(shí)驗(yàn)成本；

2.分上下孔的ibidi血管生成載玻片能去除凹液面，使成像效果更好。

圖五  成像對(duì)比

（左側(cè)ibidi血管生成載玻片無凹液面，整個(gè)視野成像清晰；右側(cè)96孔板有凹液面，中間清晰周圍模糊。）